Бланк енвд 2018: Полная информация для работы бухгалтера

Содержание

Налоговая декларация ЕНВД в 2018 году

Бланк декларации ЕНВД по форме КНД 1152016

• Скачать актуальный бланк КНД 1152016 (формат PDF).
ВНИМАНИЕ: здесь приведена новая форма декларации, вступившая в силу с 1 квартала 2017 года. Формат в официальных источниках PDF. Читать о внесённых изменениях подробнее.

Подробная инструкция по заполнению в 2018 году

ВАЖНО! Заполнять нужно начинать со 2 раздела, затем переходите к 3 разделу, а уже потом 1 раздел. Именно в таком правильном порядке расположены разделы инструкции.

Нажимайте на каждое интересующее поле инструкции, чтоб появилась подробная информация.

Важные правила заполнения

• Значение корректирующего коэффициента К2 округляются после запятой до третьего знака включительно. Значения физических показателей указываются в целых единицах.

• Все значения сумм указываются в полных рублях. Значения менее 50 копеек (0,5 единицы) отбрасываются, а 50 копеек (0,5 единицы) и более округляются до полного рубля (целой единицы).

• При заполнении Декларации рекомендовано использовать чернила черного, фиолетового или синего цвета. Но всё же лучше — чёрная ручка.

• Все буквы ПЕЧАТНЫЕ ЗАГЛАВНЫЕ!

• Если заполняете на компьютере – тоже заглавные буквы / шрифт Courier New высота 16-18 пунктов.

• Не допускается исправление ошибок с помощью корректирующего или иного аналогичного средства.

• Не нужно скреплять, сшивать декларацию.

• В пустых незаполненных клетках проставляется прочерк. Если данные суммы равны 0, то тоже проставляются прочерки.

Титульный лист

1) Укажите ИНН и КПП.

КПП — заполняют только организации. ИП ставят прочерки в этом поле.

2) Поле «Номер корректировки».

Укажите «0—» — если декларация первичная

Если сдаёте уточнённую декларацию (при наличии ошибок и неверных данных в прошлой декларации), то укажите номер корректировки, который показывает, какая по счёту декларация вами сдаётся ( 1—, 2—, 3— и т. п.)

3) Поле «Налоговый период».

Укажите:

34 — если подаёте декларацию за год

50 — если подаёте декларацию при закрытии ИП, при ликвидации (реорганизации) юрлица

95 — если подаёте декларацию при переходе на иной режим налогообложения

4) Поле «Отчётный год».

Укажите год, за который отчитываетесь

5) Поле «Представляется в налоговый орган».

Укажите код вашей налоговой. Узнать его можно на сайте ФНС России в онлайн сервисе
«Узнать код налоговой«, а далее делайте всё по инструкции.

Там будет вся информация, включая и платёжные реквизиты налоговой.

6) Поле «По месту нахождения (учета) (код)».

ИП — указывают «120»

Организации — указывают «210»

«215» — указывает организация-правопреемник реорганизированной компании

7) Поле «Налогоплательщик».

ИП — указывают ФИО полностью.

Организации — пишут своё наименование так, как указано в учредительных документах.

8) Поле «Код вида экономической деятельности по классификатору ОКВЭД».

Укажите код вашего основного вида деятельности. Его можно узнать:

— для ИП в выписке ЕГРИП

— для организаций в выписке ЕГРЮЛ

9) Поле «Форма реорганизации, ликвидация (код)»

Заполняют только реорганизированные или готовящиеся к ликвидации организации, указывая соответствующий код:

0 — ликвидация 1 — преобразование

2 — слияние 3 — разделение

5 — присоединение 6 — разделение с одновременным присоединением

ИП и остальные организации ставят прочерк.

10) Поле » ИНН/КПП реорганизованной организации».

Укажите ИНН и КПП, которые были присвоены компании до её реорганизации.

ИП и остальные организации ставят прочерки.

11) Укажите номер контактного телефона.

Формат телефона особо не имеет значения, но если придерживаться стандарта:

Мобильный +7(922)1700102

Стационарный 8(495)1234567

12) Укажите количество страниц, на которых составлена ваша декларация.

В декларации ЕНВД всегда будет минимум 4 страницы. В некоторых случаях листов раздела 2 может быть несколько. В соответствии с этим нумеруйте страницы.

13) Укажите количество листов подтверждающих документов или их копий, включая документы или их копии, подтверждающие полномочия представителя.

14) Раздел » Достоверность и полноту сведений, указанных в настоящей Декларации, подтверждаю».

Укажите:

1 — если подтверждает ИП или руководитель организации

2 — если подтверждает представитель ИП или организации

15) Поле » (фамилия, имя, отчество* полностью)»

— Если декларацию представляет ИП — это поле не заполняется, ставится только личная подпись и дата подписания.

— Если декларацию представляет организация — в этом поле построчно указывается фамилия, имя, отчество руководителя организации. Ставится его личная подпись, печать организации и дата подписания.

— Если декларацию подаёт представитель налогоплательщика- физическое лицо — в этом поле указывается построчно фамилия, имя, отчество представителя, его личная подпись и дата подписания.

— Если декларацию подаёт представитель налогоплательщика — юридическое лицо — в этом поле построчно указывается фамилия, имя, отчество физического лица, уполномоченного соответствующим документом (например, доверенность) подтверждать достоверность и полноту сведений, указанных в декларации.

16) Поле «наименование организации — представителя налогоплательщика».

Указывается наименование юридического лица — представителя налогоплательщика. Ставится дата подписания и подпись лица, сведения о котором указаны в поле «фамилия, имя, отчество* полностью», заверяемая печатью юридического лица — представителя налогоплательщика.

17) Поле » Наименование документа, подтверждающего полномочия представителя».

Указывается вид документа, подтверждающего полномочия представителя ИП или организации.

РАЗДЕЛ 2 — декларации ЕНВД

• Если вы осуществляете несколько видов деятельности ЕНВД на территории одного места (с одним ОКТМО), то данный раздел 2 декларации необходимо заполнять отдельно по каждому такому виду деятельности (несколько листов раздела 2).

• Если осуществляете один вид деятельности в нескольких отдельно расположенных местах (с разными ОКТМО), но которые относятся к одной ФНС, то данный раздел 2 декларации заполняется отдельно по каждому такому месту осуществления деятельности.

• Если осуществляете один вид и тот же вид деятельности, но в разных местах одного города (с одним ОКТМО), тогда не нужно заполнять несколько листов раздела 2, а адрес можно указать для ИП — его место жительства, для организаций — юридический адрес или адрес головного офиса (при наличии).

1) Строка 010. Укажите код вида предпринимательской деятельности.

См. таблицу базовой доходности, физических показателей по кодам и каждому виду предпринимательской деятельности в разделе про ЕНВД.

2) Строка 020. Укажите полный адрес места осуществления предпринимательской деятельности, указанного в строке 010.

Узнать индекс можете на сайте почты России здесь.

Узнать код субъекта РФ здесь.

3) Строка 030 «Код по ОКТМО».

Укажите код ОКТМО (Общероссийский классификатор территорий муниципальных образований).

Его можно узнать на сайте ФНС России «Узнай свой ОКТМО«, либо в своей налоговой.

4) Строка 040. Укажите базовую доходность вашего вида деятельности.

5) Строка 050. Укажите значение коэффициента — деффлятора К1.

В 2018 году К1 = 1,868

6) Строка 060. Укажите значение корректирующего коэффициента К2.

В каждом муниципальном образовании устанавливается своё значение для него. Этот коэффициент понижает сумму налога и различается не только по региону, но ещё и по виду деятельности.

Узнать его можно на сайте ФНС России в разделе «Особенности регионального законодательства«.

Только не забудьте поставить в настройках сайта свой регион.

Либо, чтобы не копаться в документах, можно позвонить по этому вопросу в местную налоговую.

7) Строки 070, 080, 090.

ГРАФА 2. Укажите величину физических показателей. В чём исчисляется физический показатель в зависимости от вида деятельности, см. таблицу.

Если физический показатель менялся в течение квартала, то указываем это в строке того месяца, в котором произошло изменение.

Если осуществляете один вид и тот же вид деятельности, но в разных местах одного города (с одним ОКТМО), тогда суммируйте значения физических показателей с каждого такого места.

ГРАФА 3. Укажите количество дней осуществления деятельности. Эту графу нужно заполнять в следующих случаях:

— Если вы встали на учёт ЕНВД в том квартале, за который отчитываетесь, т.е. квартал неполный получился.

— И если уходите с ЕНВД, не дождавшись окончания квартала.

Например, сдаёте декларацию за 1 квартал.

На учёт ЕНВД встали 17 января, а прекратили свою деятельность на ЕНВД 21 февраля.

Тогда, в графе 3:

строка 070 — пишете 15

строке 080 — пишите 21

строка 090 — проставляете прочерк

Т.е. В января вы работали на ЕНВД 15 дней (включая день регистрации), а в феврале 21 день.

Если вы проработали на ЕНВД полный квартал без постановки и снятия с учёта- ставьте прочерк во всех строках графы 3.

ГРАФА 4. Рассчитайте налоговую базу (то, из чего будем высчитывать окончательный налог) за каждый месяц квартала. Для этого:

1) Произведение следующих строк (строка 040 * строка 050 * строка 060).

2) Умножаем поочерёдно на значение строк 070, 080, 090.

3) Полученный результат вписываем в соответствующую строку графы 4.

4) При этом, если в графе 3 (количество дней) стоит какое-то значение, то суммы 4 графы умножаются на это соответствующее количество проработанных дней в месяце и делится на количество календарных дней месяца, за который производим расчеты.

Допустим, в январе проработали 10 дней (на учёт встали 22 числа).

Тогда: (графа 4 строки 070) * графа 3 (10 дней) / 31 (кол-во дней в январе)

8) Строка 100. Укажите общую налоговую базу за 3 месяца отчётного квартала.

строка 100 = (Строки из графы 4: 070 + 080 + 090)

9) Строка 105. Укажите налоговую ставку.

10) Строка 110. Укажите сумму налога за отчётный квартал.

Расчёт по формуле: строка 110 = строка 100 * строка 105 / 100

РАЗДЕЛ 3 — декларации ЕНВД

1) Строка 005. «Признак налогоплательщика».

Укажите:

1 — если вы налогоплательщик, производящий выплаты физическим лицам. Проще говоря, если у вас есть наёмные работники, ставите цифру 1.

2 — если у вас нет наёмных работников ни по трудовому, ни по гражданско-правовому договорам.

Речь идёт о работниках, занятых в видах деятельности ЕНВД!

2) Строка 010. Укажите сумму исчисленного налога за квартал.

Тут всё зависит от того, сколько листов раздела 2 вы заполнили:

1) Если у вас один лист раздела 2 — то просто перепишите сумму из строки 110 раздела 2;

2) Если у вас 2 и более листов раздела 2 — сложите все суммы строчек 110 из каждого такого листа раздела 2 и полученный результат запишите в строчку 010.

3) Строка 020. Укажите сумму страховых взносов, уже уплаченную в отчётном квартале за работников, занятых в видах деятельности ЕНВД.

4) Строка 030. Укажите сумму страховых взносов, уже уплаченную в отчётном квартале за себя.

5) Строка 040. Укажите итоговую сумму налога ЕНВД, подлежащую уплате за отчётный квартал.

Рассчитываем следующим образом:

1) Если в строке 005 выбрали 1, тогда:

строка 040 = стр. 010 — стр. 020 при этом строка 040 должна быть > = 50 % от строки 010

Объясняем. Так как в этом случае налогоплательщик имеет работников, то налог можно уменьшить не более, чем на 50 % на сумму страховых взносов за работников. Поэтому строка 040 не может быть меньше половины от строки 010, даже если строка 020 (взносы за работников) будет равна строке 010.

2) Если в строке 005 выбрали 2, тогда:

строка 040 = строка 010 — строка 030

В данном случае налогоплательщик без работников, поэтому можно уменьшить налог на 100 % суммы всех фиксированных страховых взносов, уплаченных за себя.

РАЗДЕЛ 1 — декларации ЕНВД

1) Строка 010 «Код по ОКТМО».

Укажите код ОКТМО (Общероссийский классификатор территорий муниципальных образований).

Его можно узнать на сайте ФНС России, либо в своей налоговой.

2) Строка 020. Укажите общую сумму налога, подлежащую уплате за отчётный квартал.

— Перепишите сумму из строки 040 раздела 3.

— Но если вы осуществляете деятельность в разных местах (с разным ОКТМО), но которые при этом относятся к одной налоговой инспекции, тогда рассчитываем сумму налога отдельно по каждому такому ОКТМО.

Рассчитываем по формуле:

строка 020 = стр. 040 раздела 3 * (Сумма строк 110 всех листов раздела 2 по данному ОКТМО / строка 010 раздела 3)

3) Раздел внизу листа » Достоверность и полноту сведений, указанных на данной странице, подтверждаю».

Ставится дата подписания и личная подпись того лица, которое подписывало титульный лист декларации.

Формы документов

Сообщение плательщика (иного обязанного лица) об участии в иностранной организации

Уведомление об осуществлении деятельности с уплатой единого налога с индивидуальных предпринимателей и иных физических лиц

Уведомление о начале (прекращении) осуществления ремесленной деятельности

Уведомление о выборе объекта налогообложения, освобождаемого от уплаты налога на недвижимость

Договор найма жилого помещения частного жилищного фонда граждан

Типовой договор найма жилого помещения государственного жилищного фонда

Договор аренды (субаренды) нежилых помещений

Информация о заключении (незаключении, отсутствии) договоров на оказание услуг в сфере агроэкотуризма в отчетном году

Декларация о доходах и имуществе (для лиц, представляющих декларацию о доходах и имуществе по письменному требованию налогового органа)

Налоговая декларация (расчет) по подоходному налогу с физических лиц с доходов плательщиков, не признаваемых налоговыми резидентами Республики Беларусь, полученных от физических лиц, не являющихся индивидуальными предпринимателями, за реализованные им тов

Налоговая декларация (расчет) по подоходному налогу с физических лиц

Договор аренды (субаренды) машино-мест

Уведомление об изменении площади недвижимости используемой в предпринимательской деятельности при УСН

Уведомление об использовании в предпринимательской деятельности капитальных строений (зданий, сооружений), их частей

Налоговая декларация налогового агента по подоходному налогу с учетом изменений

Расчет по сбору за размещение (распространение) рекламы

Книга учета товаров (готовой продукции)

Книга учета сырья и материалов

Книга учета сумм НДС

Книга учета отдельных предметов в составе оборотных средств

Книга учета основных средств

Книга учета обязательств налоговым агентом

Книга учета нематериальных активов

Книга учета доходов и расходов

Книга учета валовой выручки от реализации товаров (работ услуг)

Книга суммового учета товаров

Акт закупки товаров, сырья, материалов

Книга учета доходов и расходов организаций и индивидуальных предпринимателей, применяющих упрощенную систему налогообложения

Налоговая декларация налогового агента по подоходному налогу с физических лиц

Налоговая декларация (расчет) по УСН

Налоговая декларация (расчет) по УСН. Сведения о размере и составе использованных льгот

Налоговая декларация (расчет) по подоходному налогу

Налоговая декларация (расчет) по подоходному налогу. Сведения о размере и составе использованных льгот

Налоговая декларация (расчет) по единому налогу

Налоговая декларация (расчет) по единому налогу. Сведения о размере и составе использованных льгот

Налоговая декларация (расчет) по акцизам. Приложение 3

Налоговая декларация (расчет) по акцизам. Приложение 2

Налоговая декларация (расчет) по акцизам. Приложение 1

Налоговая декларация (расчет) по акцизам

Инструкция о порядке заполнения налоговых деклараций (расчетов) по налогам (сборам), книги покупок

Налоговая декларация (расчет) по единому налогу для производителей сельскохозяйственной продукции

Уведомление об отказе от применения УСН

Уведомление о переходе на УСН

Налоговая декларация (расчет) по налогу на доходы

Налоговая декларация (расчет) по налогу на доходы. Сведения о размере и составе использованных льгот

Налоговая декларация (расчет) по НДС. Приложение 1

Налоговая декларация (расчет) по НДС. Приложение 2

Налоговая декларация (расчет) по НДС. Приложение 3

Налоговая декларация (расчет) по НДС. Приложение 4

Налоговая декларация (расчет) по НДС. Приложение 5

Налоговая декларация (расчет) по НДС. Приложение 6

Налоговая декларация (расчет) по НДС. Приложение 7

Налоговая декларация (расчет) по НДС. Приложение 8

Налоговая декларация (расчет) по НДС. Приложение 9

Налоговая декларация (расчет) по НДС. Приложение 10

Налоговая декларация (расчет) по НДС. Приложение 11

Налоговая декларация (расчет) по НДС. Приложение 12

Налоговая декларация (расчет) по НДС

Архив форм налоговых деклараций и иных документов 2015 — 2021

Налоговая декларация налогового агента по подоходному налогу с учетом изменений

Расчет по сбору за размещение (распространение) рекламы

Сведения о физических лицах, работающих в сельской местности

Постановление МНС от 05. 04.2022 № 15 «О предоставлении сведений»

Уведомление плательщика-иностранной организации

Налоговая декларация (расчет) по налогу на прибыль для иностранных организаций

Налоговая декларация (расчет) по налогу на доходы

Налоговая декларация (расчет) налогового агента по подоходному налогу с физических лиц

Уведомление о переходе на единый налог для производителей сельскохозяйственной продукции

Расчет НДС исходя из налоговой базы и доли суммы НДС при реализации товаров по розничным ценам

Налоговая декларация (расчет) по НДС

Налоговая декларация (расчет) по акцизам

Книга покупок

Сведения о принятых от граждан суммах арендной платы за земельные участки, находящиеся в государственной собственности

Сведения о площади, кадастровой стоимости земельного участка, предоставленного плательщику

Налоговая декларация (расчет) по экологическому налогу за хранение, захоронение отходов производства

Налоговая декларация (расчет) по экологическому налогу за транспортировку по территории Республики Беларусь магистральными трубопроводами нефти и (или) нефтепродуктов транзитом

Налоговая декларация (расчет) по экологическому налогу за сброс сточных вод в окружающую среду

Налоговая декларация (расчет) по экологическому налогу за выбросы загрязняющих веществ в атмосферный воздух

Налоговая декларация (расчет) по утилизационному сбору

Налоговая декларация (расчет) по транспортному налогу с организаций

Налоговая декларация (расчет) по сбору с заготовителей

Налоговая декларация (расчет) по оффшорному сбору

Налоговая декларация (расчет) по налогу на прибыль для белорусских организаций

Налоговая декларация (расчет) по налогу на недвижимость организаций

Налоговая декларация (расчет) по налогу за добычу (изъятие) природных ресурсов

Налоговая декларация (расчет) по земельному налогу (суммы арендной платы за земельные участки) с организаций

Инструкция о порядке заполнения налоговых деклараций (расчетов) по налогам (сборам), книги покупок

Налоговая декларация (расчет) по налогу на доходы от осуществления лотерейной деятельности и проведения интерактивных игр

Налоговая декларация (расчет) по налогу на игорный бизнес

Уведомление об отказе от применения УСН

Уведомление о переходе на УСН

Налоговая декларация (расчета) по УСН

Архив форм налоговых деклараций и иных документов 2017 — 2021

Обратите внимание

Перейти

преподавателей и сотрудников — 16 октября 2018 г.

| Экологический дизайн

Перейти к содержанию

Поиск

Введите условия для поиска.

Другие способы поиска:

Обновления ENVD

Печать с мобильных устройств и планшетов

Черно-белый принтер в главном офисе теперь может принимать простые задания на печать по электронной почте, что позволяет преподавателям и сотрудникам отправлять документы на печать непосредственно со своих планшетов и мобильных устройств.

Для печати по электронной почте отправьте документ в виде вложения по адресу [email protected] . Отправьте пустое электронное письмо с вложением для печати — любой текст в электронном письме, включая подписи, также будет распечатан. Стандартные, черно-белые файлы PDF и Word размером 8,5 X 11 лучше всего подходят для этого метода, поскольку возможности настройки при печати с мобильных устройств на HP ограничены. Для получения дополнительной информации свяжитесь с Даниэлем Пересом.

Отметьте свои календари

ENVD Graduate School Fair

3-я ежегодная ярмарка Graduate School Fair состоится завтра, в среду, 17 октября. Пожалуйста, пригласите студентов посетить ее. Обед для представителей начнется в 11:00. Преподаватели и сотрудники могут присутствовать и общаться с представителями на обеде и во время ярмарки.

Среда, 17 октября, 11:30 – 13:30, ENVD 134

Глобальный семинар: Медельин, Колумбия

ENVD Abroad Global Seminar Student Studio

Информационная сессия Глобального семинара 2019 года в Медельине, Колумбия, состоится в ENVD 102 18 октября в 17:30.

Встретьтесь и угостите директора

Директор ENVD Пол Чиновски будет проводить сессии открытого диалога в течение октября. Приглашаются все студенты ENVD.

Улучшение жизни сообщества в промышленных домах: от права собственности жильцов к изменению законодательства

Когда Суббота, 20 октября 2018 г. , 9:00–12:30 Где Здание экологического дизайна, комната 134 1060 18th Street Boulder, Colorado 80304 Сообщества промышленных домов сталкиваются со многими проблемами. Обслуживание базовой инфраструктуры (вода, канализация, улицы, освещение), повышение арендной платы за землю и правила парковки являются одними из вопросов потенциального конфликта между…

Стажировки за рубежом Информационная сессия

ENVD проведет информационную сессию о летних стажировках за границей во вторник, 23 октября, в 4:15 в ENVD 134. Пожалуйста, пригласите своих студентов принять участие.

Научная коммуникация и образование в области изменения климата

Доктор Мари Ойала, старший преподаватель Университета Эребру в Швеции, выступит с докладом на тему «Молодежь и коммуникация в области изменения климата: о важности учета эмоций».

Преподаватели и студенты, которые хотят встретиться за чашечкой кофе или пообедать с доктором Оджала, должны связаться с Suzanne.balog@colorado. edu до 26 октября.

Понедельник, 5, 4 ноября – 17:15, SEEC C #120

Ответ на лекцию

В случае, если вы пропустили это

Будьте в порядке, будьте готовы с помощью ENVD, CU Boulder Support and Resources

Support Resources

Поскольку мы приближаемся к середине семестра, мы, ваши преподаватели, консультанты и вспомогательный персонал обращаемся к вам, чтобы напомнить вам доступных вам ресурсов, если вы испытываете стресс, тревогу, депрессию, травму или иным образом чувствуете, что вам нужно обратиться за помощью. ENVD и CU Boulder готовы предоставить вам надежную поддержку.

CU Boulder Today Grad Student Edition

CU Boulder сегодня недавно запустил ежемесячную версию своего журнала для аспирантов. Если вы являетесь аспирантом и хотели бы получить публикацию, заполните форму, которая будет добавлена в список рассылки.

Проектирование для устойчивых сообществ

В центре внимания выпускников

Сразу после окончания факультета экологического дизайна в мае 2018 года Клэр Дерр занялась проектированием и поддержкой устойчивых сообществ с Pyatt Studio и Building Cooperative. Pyatt Studio — это архитектурно-планировочная фирма, базирующаяся в Боулдере и специализирующаяся на общественных проектах.

Посещение объекта ENVD и экскурсии

Посещение национального парка Роки-Маунтин, виды радуги

Посещение объекта учащимися Экскурсии

Инструктор Стейси Шульте, курс по сохранению и отдыху на американском Западе, на прошлой неделе ездила в национальный парк Роки-Маунтин. Учащиеся узнали о стратегиях проектирования управления парками, которые используются для снижения воздействия высокой посещаемости. Специалист по ресурсам Скотт Эссер провел класс по разным местам в парке…

Вернуться к началу страницы

Полногеномное секвенирование и таксономическое профилирование двух Pantoea sp. выделен из образцов окружающей среды в Израиле

BMC Genom Data. 2022 г.; 23: 31.

Опубликовано онлайн 2022 апреля 21. doi: 10.1186/s12863-022-01049-7

, ^{, ^{, ^{, ^{, ^{, ^{, ^и}}}}}}

и информация о лицензии Отказ от ответственности

Заявление о доступности данных

Цель

В рамках исследования, направленного на выделение бактерий, секретирующих соединения, ингибирующие рост, культуры Francisella tularensis были имплантированы в образцы окружающей среды и проверены на наличие зон ингибирования на агаре. Были выделены две антибиотикоподобные секретирующие бактерии, расшифрована их геномная последовательность, и анализ таксономического профиля классифицировал их как принадлежащие к роду Pantoea .

Описание данных

Два бактериальных изолята с зонами ингибирования роста до F. tularensis (LVS) анализировали с использованием технологии Oxford Nanopore (ONT). Была выполнена предварительная сборка прочтений de novo с последующим таксономическим профилированием на основе анализа многолокусных последовательностей (MLSA) и измерения средней идентичности нуклеотидов (ANI). Геномные последовательности привели к идентификации двух разных видов Pantoea , обозначенных как EnvD и EnvH.

Последующая сборка генома de novo сгенерировала 5 и 10 контигов для EnvD и EnvH соответственно. Самый большой контиг (4 008 183 п.н. и 3 740 753 п.н. для EnvD и EnvH соответственно) в значительной степени перекрывается с хромосомой близкородственных Pantoea вида. Значения ANI, рассчитанные для обоих изолятов, выявили два явно новых вида рода Pantoea .

Наше исследование расшифровало идентичность двух бактерий, продуцирующих антибиотикоподобные соединения, и геномная последовательность показала, что они представляют разные виды Pantoea .

Ключевые слова: Pantoea , Образцы окружающей среды, Секвенирование всего генома, Oxford nanopore, Сборка De novo, Таксономия

Pantoea — род грамотрицательных бактерий, принадлежащих к семейству Erwiniaceae. Эти бактерии были выделены из множества источников окружающей среды (таких как растения, животные, вода, почва и человек). Они широко распространены в природе, и уже зарегистрировано более 25 видов [1–4]. В этом исследовании мы представляем таксономическое профилирование двух изолятов из окружающей среды, которые были идентифицированы по их способности ингибировать рост колоний F. tularensis (LVS). Изоляты секвенировали с помощью длинного считывания и собирали с помощью сборки de novo. Мы рассчитали показатель ANI, чтобы установить родство видов, и метод MLSA был реализован для создания филогенетического дерева, показывающего эти варианты как новые Pantoea вида.

В ходе этого исследования было взято более 20 проб окружающей среды из различных географических точек Израиля (природные источники). Образцы готовили путем протирания 20-сантиметрового участка ² городских асфальтированных дорог 3 стерильными ватными тампонами (Copan Italia SPA), асептически смоченными в стерильном фосфатно-солевом буферном растворе (PBS). Тампоны выбрасывали после экстракции вортексом в 5 мл PBS. Через 2 мин. пассивного оседания пыли и грязи в новую стерильную пробирку перенесли 4,2 мл. Аликвоту 0,1 мл каждого образца окружающей среды смешивали с 0,1 мл PBS, содержащего 10 ⁸ КОЕ/мл индикаторных бактерий ( F. tularensis LVS), смесь наносили на цистеиновый сердечный агар с гемоглобином (CHA, Difco), чашки инкубировали в течение 2 дней при 37 °C и отслеживали наличие колоний, демонстрирующих ингибирование зона для индикаторной деформации. Несколько таких колоний были дополнительно выделены в чистые культуры на CHA, и было подтверждено их ингибирование LVS. Два изолята продемонстрировали разную способность к росту в бульоне для инфузии мозга и сердца и были обозначены здесь как EnvD (из промышленной зоны Тальпиот, Иерусалим) и EnvH (из района Ромема, Хайфа). Для очистки ДНК колонии EnvD и EnvH выращивали на CHA, суспендировали до высокой плотности в 1 мл PBS, смешивали 1:1 с ATL-буфером, нагревали при 100 °C в течение 30 мин перед очисткой ДНК с использованием мининабора QIAamp DNA blood minikit (Qiagen). . Секвенирование всего генома было проведено в центре GenoHub (https://genohub.com) с использованием технологии Oxford Nanopore MinION. Библиотеки для EnvD и EnvH были подготовлены с использованием SQK-LSK109.набор для секвенирования лигирования (Oxford Nanopore Technologies), и секвенирование проводили с использованием проточной кюветы R9. Базовый вызов выполнялся с помощью Guppy v 4.4.2. Всего было получено 210 000 прочтений для EnvD (средняя длина 3854 бит/с) и 190 000 прочтений для EnvH (средняя длина 1881 бит/с), в результате чего охват составил 155x и 89x соответственно (файл данных 1) [5]. Сборка

De novo проводилась с помощью реализации Flye [6], предназначенной для сборки длинных ридов, сгенерированных ONT. Для EnvD было получено пять контигов, самый большой из которых имеет длину 4 008 183 п.н., поэтому значение N50 составляет 4 008 183. Сгенерированные EnvH чтения были собраны в общей сложности в 10 контигов, самый длинный из которых составлял 3 740 753 бита в секунду (что, следовательно, является значением N50). Грубая и предварительная оценка таксономического родства двух изолятов, проведенная с помощью Blast-анализа [7] по базе данных нуклеотидов (nt, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/нуклеотид/), выявила сходство с Род Pantoea . Впоследствии самый длинный контиг каждого изолята сравнили со всеми общедоступными последовательностями Pantoea (Национальный центр биотехнологической информации, NCBI), показав, что наиболее подходящими совпадениями для EnvD и EnvH являются Pantoea agglomerans и Pantoea stewartii соответственно. . Соответственно, контиги, сгенерированные сборкой, были выровнены по своим ближайшим видам с помощью Mauve [8]. Выравнивания показывают почти полное покрытие эталонной хромосомы самым большим контигом как для EnvD, так и для EnvH. Кроме того, два оставшихся контига перекрывают плазмидные области в эталонных геномах (файл данных 2) [9].].

Чтобы дополнительно охарактеризовать, могут ли секвенированные геномы быть связаны с одним из уже известных видов Pantoea , мы использовали показатель ANI как хорошо зарекомендовавший себя показатель сходства всего генома [10–14]. Значение ANI оценивали с помощью алгоритма FastANI [12]. Попарные значения ANI не более 82% были получены для каждого из секвенированных геномов с геномами, представляющими известный вид Pantoea [15]. Согласно общепринятому пороговому значению 95% используется в качестве границы для разграничения видов [14, 16], оказывается, что EnvD и EnvH составляют новые виды в пределах рода Pantoea . Следует отметить, что парное значение ANI между EnvD и EnvH составляет 83%, что представляет собой две разные линии передачи.

Для присвоения таксономического профиля двух изолятов мы внедрили метод типирования Multi Locus Sequence Analysis (MLSA), адаптированный для филогенетического анализа вида Pantoea [17, 18], с использованием пяти основных генов, которые эффективны для видов- уровень разграничения рода Pantoea : fusA , gyrB , leuS , pyrG и rpoB [1]. Последовательности генов, ортологичных EnvD и EnvH, были извлечены из последовательностей контигов, охватывающих области хромосом (контиг 4 для EnvD и контиг 3 для EnvH), и объединены в мини-ген. Кроме того, пять кодирующих белок генов были выделены из 37 репрезентативных, эталонных и/или типовых штаммов видов Pantoea и Tatumella (полный список видов, включенных в набор из 37 геномов, см. в [17]). . Множественное выравнивание 37 конкатенированных последовательностей вместе с конкатенированными последовательностями, происходящими из EnvD и EnvH, было построено с использованием алгоритма MAFFT (множественное выравнивание с использованием быстрого преобразования Фурье) [19]. ] устройства MegAlign™ Pro (© 1993–2020) (DNASTAR®). Филогенетический анализ выровненных последовательностей был проведен с использованием инструмента PhyML [20], который оценивает филогении максимального правдоподобия (NGPhylogeny.fr [21]). Каждый из новых изолятов, EnvD и EnvH, образует отдельную ветвь (файл данных 3) [22]. В то время как EnvH связан с видами Pantoea stewartii , Pantoea ananatis и Pantoea allii , EnvD не только является ответвлением от отдельного кластера, но и относительно удален от видов в этом кластере (который включает, среди прочего, 9 видов).0021 Pantoea agglomerans , что подтверждает предварительное назначение, описанное выше для EnvD).

В заключение, две бактерии, ингибирующие рост, из образцов окружающей среды, собранных в двух различных районах Израиля, были идентифицированы и отнесены к роду Pantoea . Их таксономическое профилирование показало, что эти бактерии могут быть классифицированы как новые виды Pantoea , отличающиеся от известных видов Pantoea , описанных на сегодняшний день. Дальнейшая экспериментальная характеристика механизма, вовлеченного в ингибирование роста LVS этих Pantoea сейчас выполняется. Ссылки на файлы данных 1–4 и наборы данных 1–3 см. в таблице. .

Таблица 1

Обзор файлов данных/наборов данных

Метка	Имя файла данных/наборов данных	Типы файлов (расширение файла)	Идентификатор данных2 и репозитория1 (DOI
Файл данных 1	Показатели секвенирования и сборки	Файл Portable Document Format (.pdf)	https://doi.org/10.6084/m9.figshare.15111765.v1 [5]
Файл данных 2	Выравнивание контигов по эталонному геному pdf)	https://doi. org/10.6084/m9.figshare.15105198.v1 [9]
Файл данных 3	Значения ANI для Pan spea 02. EnvD и Pantoea sp. EnvH	Файл в формате Portable Document Format (.pdf)	https://doi.org/10.6084/m9.figshare.19204658.V2 [15]
Файл данных 4	. ://doi.org/10.6084/m9.figshare.15111588.v3 [22]
Набор данных 1	Секвенирование Pantoea sp. EnvD и Pantoea sp. EnvH	Файл Fastq (.fastq.gz)	SRP316834 [23]
Набор данных 2	Сборка генома Pantoea sp. EnvD	FASTA / GenBank / ASN.1	{«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«текст»:»JAGTWO000000000.1″,»term_id»:»2051287946″,»term_text»: «JAGTWO000000000.1»}}JAGTWO000000000.1 [24]
Набор данных 3	Сборка генома Pantoea sp. EnvH	FASTA / GenBank / ASN.1	{«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«текст»:»JAGTWN000000000.1″,»term_id»:»2051287947″,»term_text»:»JAGTWN000000000.1″}}JAGTWN000000000.1 [25]

Открыть в отдельном окне почти покрывают область хромосомы, некоторые другие области секвенированных геномов EnvD и EnvH частично покрыты

По практическим соображениям филогенетическое родство двух видов Pantoea EnvD и EnvH основано на ограниченном наборе данных из 37 известных Вид Pantoea , состоящий из репрезентативных, эталонных и/или типовых штаммов видов Pantoea и Tatumella .

Мы благодарим доктора Ади Бет-Дин за плодотворные обсуждения.

MLSA	Multi Locus Sequence Analysis
ANI	Average Nucleotide Identity
ONT	Oxford Nanopore Technologies
MAFFT	Множественное выравнивание с использованием быстрого преобразования Фурье
PhyML	Филогения максимального правдоподобия

YGD: проанализированы данные и написана рукопись; ICG: проанализировала данные; OI: выполнил секвенирование и написал рукопись; ОС: проводил эксперименты; ТА: провел эксперименты; СР: проводил эксперименты и помогал интерпретировать результаты; РБ: разработал эксперименты, руководил проектом и написал рукопись; AZ: руководил биоинформационным анализом и написал рукопись. Все авторы прочитали и одобрили окончательный вариант рукописи.

Это исследование не получило внешнего финансирования.

Файлы данных 1–4, описанные в этом примечании к данным, могут быть свободно и открыто доступны на Figshare (https://figshare.com/) [5, 9, 22]. Наборы данных 1–3 доступны в базе данных NCBI. Необработанные чтения были отправлены в архив чтения последовательностей NCBI под номером доступа SRP316834 для Pantoea sp. EnvD и Pantoea sp. EnvH (набор данных 1) [23–25]. Геномные сборки двух образцов были отправлены в NCBI GenBank и доступны под инвентарным номером {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»JAGTWO000000000″,»term_id»:»2051287946″,»term_text»:»JAGTWO000000000″}}JAGTWO000000000 для Pantoea sp. EnvD и инвентарный номер {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»JAGTWN000000000″,» term_id»:»2051287947″,»term_text»:»JAGTWN000000000″}}JAGTWN000000000 для Pantoea sp.EnvH (наборы данных 2–3) [24, 25].

Согласие на публикацию

Неприменимо

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Примечание издателя

Springer Nature остается нейтральной в отношении юрисдикционных претензий в опубликованных картах и институциональной принадлежности.

1. Тамбонг Дж.Т. Таксогеномика и систематика рода Pantoea. Фронт микробиол. 2019;10:2463. doi: 10.3389/fmicb.2019.02463. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

2. Agarwal G, Choudhary D, Stice SP, MyersGitaitis BKRD, Venter SN, et al. Пангеномный анализ Pantoea ananatis выявил гены, связанные с патогенностью лука. Фронт микробиол. 2021;12:684756. дои: 10.3389/fmicb.2021.684756. [Статья бесплатно PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

3. Agarwal G, Gitaitis RD, Dutta B. Пангеном нового подвида indologenes Pantoea stewartii раскрывает гены, участвующие в патогенности лука, и доказательства латерального переноса генов. Микроорганизмы. 2021;9(8):1761. doi: 10.3390/microorganisms9081761. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

4. Stice SP, Shin GY, De Armas S, Koirala S, Galvan GA, Siri MI, et al. Распределение кластеров генов вирулентности среди Pantoea spp. Фронт завод науч. 2021;12:643787. doi: 10.3389/fpls.2021.643787. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

5. Файл данных 1: показатели секвенирования и сборки. Figshare: 10.6084/m9.figshare.15111765.v1 (2021).

6. Колмогоров М., Бикхарт Д.М., Бехсаз Б., Гуревич А., Райко М., Шин С.Б., и соавт. metaFlye: масштабируемая сборка метагенома с длительным чтением с использованием графов повторов. Нат Методы. 2020;17(11):1103–1110. doi: 10.1038/s41592-020-00971-x. [PubMed] [CrossRef] [Академия Google]

7. Альтшул С.Ф., Гиш В., Миллер В., Майерс Э.В., Липман Д.Дж. Базовый инструмент локального поиска выравнивания. Дж Мол Биол. 1990;215(3):403–410. doi: 10.1016/S0022-2836(05)80360-2. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

8. Darling AC, Mau B, Blattner FR, Perna NT. Розовато-лиловый: множественное выравнивание консервативной геномной последовательности с перестройками. Геном Res. 2004;14(7):1394–1403. doi: 10.1101/gr.2289704. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

9. Файл данных 2: сопоставление контигов с эталонным геномом. Фиговая доля: 10,6084/м9.figshare.15105198.v1 (2021).

10. Фигерас М.Дж., Беаз-Идальго Р., Хоссейн М.Дж., Лайлес М.Р. Таксономическая принадлежность новых геномов должна быть подтверждена с использованием средней нуклеотидной идентичности и мультилокусного филогенетического анализа. Объявление генома. 2014;2(6):e00927–14. doi: 10.1128/genomeA.00927-14. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

11. Arahal DR. Полногеномный анализ: средняя идентичность нуклеотидов. Методы микробиологии. 2014;41:103–22.

12. Джейн С., Родригес Р.Л., Филлиппи А.М., Константинидис К.Т., Алуру С. Высокопроизводительный анализ АОН 90K прокариотических геномов выявляет четкие границы видов. Нац коммун. 2018;9(1):5114. doi: 10.1038/s41467-018-07641-9. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

13. Konstantinidis KT, Tiedje JM. Геномные идеи, которые расширяют определение вида прокариот. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(7):2567–2572. doi: 10.1073/pnas.0409727102. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

14. Горис Дж., Константинидис К.Т., Клаппенбах Дж.А., Коэнье Т., Вандамм П., Тиедже Дж.М. Значения гибридизации ДНК-ДНК и их связь со сходством последовательностей всего генома. Int J Syst Evol Microbiol. 2007; 57 (часть 1): 81–9.1. doi: 10.1099/ijs.0.64483-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

15. Файл данных 3: Таблица оценок ANI для Pantoea sp. EnvD и Pantoea sp. EnvH. Figshare: 10.6084/m9.figshare.19204658.v2 (2022).

16. Рихтер М., Росселло-Мора Р. Изменение геномного золотого стандарта для определения прокариотических видов. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106(45):19126–19131. doi: 10.1073/pnas.0906412106. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

17. Tambong JT, Xu R, Kaneza CA, Nshogozabahizi JC. Углубленный анализ мультилокусной филогении идентифицирует leuS как надежный филогенетический маркер для рода Pantoea . Эвол Биоинформ Онлайн. 2014;10:115–125. doi: 10.4137/EBO.S15738. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

18. Deletoile A, Decre D, Courant S, Passet V, Audo J, Grimont P, et al. Филогения и идентификация вида Pantoea и типирование штамма Pantoea agglomerans с помощью мультилокусного секвенирования генов. Дж. Клин Микробиол. 2009 г.;47(2):300–310. doi: 10.1128/JCM.01916-08. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

19. Katoh K, Standley DM. MAFFT: итеративное уточнение и дополнительные методы. Методы Мол Биол. 2014;1079:131–146. doi: 10.1007/978-1-62703-646-7_8. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

20. Guindon S, Dufayard JF, Lefort V, Anisimova M, Hordijk W, Gascuel O. Новые алгоритмы и методы для оценки филогений с максимальным правдоподобием: оценка производительности PhyML 3.